詳解二手液相色譜法之手性色譜法

二手液相色譜 法之 手性色譜法
不少有機藥物的結構中有不對稱碳原子，又稱手性碳原子，有手性碳原子的藥物具有旋光性。立體(ti) 構型不同的一對對映體(ti) ，其藥效、毒副作用往往不相同。例如抗高血壓藥物a -甲基多巴是S-(-)體(ti) ;又如氯黴素(含有二個(ge) 手性碳原子)，隻有D-(-)異構體(ti) 有效。而L-(+)異構體(ti) 完全無效。沙利度胺(反應停)的兩(liang) 個(ge) 對映體(ti) 對小鼠鎮靜作用的效價(jia) 相近，但隻有左旋異構體(ti) 才有胚胎毒及致畸作用。因此，對映體(ti) 的分離，在藥物的製備和質量控製方麵，都具有重要的意義(yi) 。對映體(ti) 在普通條件下的理化性質是相同的，因此分離對映體(ti) 需要在手性條件下進行。分離對映體(ti) 的色譜方法稱為(wei) 手性色譜法。二手液相色譜法之手性色譜法分為(wei) 間接法和直接法兩(liang) 種。間接法是將對映體(ti) 與(yu) 一定的手性衍生化試劑反應，使其由對映體(ti) 轉變為(wei) 非對映體(ti) ，再利用他們(men) 理化性質的差異，用-般的色譜條件進行分離。直接法不需作衍生化反應，直接利用手性色譜柱或手性流動相進行分離，應用較多，以下主要介紹二手液相色譜法之手性色譜法的直接法。

1手性固定相
手性藥物拆分前的對映體(ti) 通常以鏡象存在，即以外消旋體(ti) 形式存在。用常規分析和製備方法不能將其拆分，需引入不對稱( 即手性)環境，使欲拆分的對映體(ti) (樣品)、 手性作用物(比如固定相)和手性源形成一個(ge) 非對映異構分子的絡合物。為(wei) 了形成這樣一種分子絡合物，分子之間要有-種同時相互存在的作用力，以保持分子的空間定位。Dalgliesh 認為(wei) 至少要有三個(ge) 作用力，其中一個(ge) 要有立體(ti) 選擇性，可以是吸引的，也可以是排斥的。這就是“三點相互作用”理論。如果對映體(ti) 中某一種對映體(ti) 正好與(yu) 此三個(ge) 作用點配對，相互作用較強，保留時間就長。而另一種對映體(ti) 因空間構成不同，不能完全配對，作用相對較弱，保留時間就短，從(cong) 而可以得到分離。固定相的作用可以是氫鍵、偶極一偶極作用、π_π作用、靜電作用、疏水作用或空間作用等。
常用的手性固定相有以下幾種：
(1)Pirkle型手性固定相
Pickle型手性固定相是由美國學者Pirkle主持研製的，主要有π -堿性(斥電子基)手性固定相和π酸性(吸電子基)手性固定相。在分離的過程中，化合物與(yu) 固定相之間發生π-π電荷轉移相互作用，此類固定相為(wei) 電荷轉移型手性固定相。如DNBPG-CSP是把(R)-N3，5-二硝基苯甲酰苯基甘氨酸( dinitrobenzy1 phenylglycin) 鍵合到氨丙基矽膠上。
(2)蛋白質類手性因定相
蛋白質是由手性亞(ya) 基團氨基酸組成的大分子物質，蛋白質類手性固定相是將蛋白質通過氨基酸鍵合到矽膠上而製成的。常用的蛋白質類手性固定相有牛血清蛋白(RSA)和人血a1-酸性糖蛋白(AGP) 的手性固定相，商品有Chiral AGP, Resolvosil, Enantio Pac等 。蛋白質類手性固定相應用範圍較廣，效果良好，但該類固定相的譜柱容裏較小。常用洗脫係統是磷酸鹽緩衝(chong) 溶液(PH4~7)， 離子強度為(wei) 0~ 500mmol,有機改性劑不得超過5%。用蛋白質類手性固定相拆分酸性和堿性傾(qing) 倒物對映體(ti) 時，流動相內(nei) 可分別加少童離子對試劑，如.N,N-二甲基辛胺，叔丁胺氫溴酸鹽和辛酸，以獲得理想的分離結果。
(3)多糖類手性固定相
多糖類手性固定相中應用最多的是環糊精。環糊精(cyclodextrin, CD)是一類環形寡聚糖，為(wei) 手性高分子物質，根據分子中葡萄糖單元的個(ge) 數不同，環糊精可分為(wei) a、β、γ三類，他們(men) 分別由6、7、8個(ge) D_吡喃葡萄糖組成，將CD分別通過矽烷鏈連接在矽膠表麵就構成環糊精手性固定相。環糊精分子成錐桶狀，內(nei) 腔的直徑由組成環糊精的葡萄糖個(ge) 數決(jue) 定，如常用的_環糊精由7個(ge) 葡萄糖分子組成，內(nei) 腔直徑為(wei) 0.8nm。用環糊精手性固定相進行分離時，首先要求被拆分的組分進人洞穴，形成包合物，保留時間以組分能否進人洞穴及其緊密的程度而定，環糊精環上還有多個(ge) 手性中心，能選擇性地與(yu) 對映體(ti) 作用，從(cong) 而導致對映異構體(ti) 的保留不同而被分離。如用β-環糊精手性固定相已經成功地分離了二茂鐵等金屬有機絡合物、氨基酸以及生物堿等。除環糊精外，多糖類的手性固定相還可以用纖維素、直鏈澱粉作成，如纖維素三醋酸醋手性固定相、纖維素三苯甲酸醋手性固定相和纖維素氨基甲酸酯手性固定相等。
(4)冠醚(Grown ether) 類手性固定相.
冠醚與(yu) 環糊精類似，是本身具有手性的低聚糖，是含醚鍵的環狀化合物，呈王冠狀結構，外層是親(qin) 脂性的乙撐基，環的內(nei) 層是富電子的雜原子，如氧、氮、硫等。通常使用的是18-冠-6的衍生物，健合在聚苯乙煒骨架或矽膠上，形成冠醚手性固定相。用冠醚手性固定相分離對映體(ti) 時，不同對映異構體(ti) 因與(yu) 冠醚環腔形成的主客體(ti) 絡合物的穩定性不同而被分離。在冠醚上引人雙萘基，雙萘基可以形成“手性牆”增加固定相的立體(ti) 選擇性。能質子化的氨基化合物，特別是氨基酸對映體(ti) 在冠醚手性固定相上可以得到很好的分離。

  2.手性流動相拆分法
手性流動相拆分法是將手性試劑添加到流動相中，利用手性試劑與(yu) 對映異構體(ti) 結合的穩定常數不同或結合物在固定相上分配的差異進行分離。近年來，手性流動相拆分法已廣泛應用於(yu) 藥物對映體(ti) 的拆分。此法的最大優(you) 勢在於(yu) :可采用普通的非手性固定相，不需對樣品.進行衍生化，手性添加物本身可流出，也可更換，同時添加物的可變範圍較寬，穩定性好，且價(jia) 格便宜。
(1)配體(ti) 交換型手性添加劑
配體(ti) 交換型手性添加劑由手性配基和含二價(jia) 金屬離子的鹽組成o手性配基多為(wei) 具有光學活性的氨基酸及其衍生物，他們(men) 和二價(jia) 金屬離子螯合，分布於(yu) 流動相中，遇到待分離的對映異構體(ti) 時，即形成配合物，再在流動相和固定相之間分配而實現分離。分離的機理-般認為(wei) .是配基和金屬離子形成的螯合物被吸附在固定相上，形成動態的手性固定相而發揮作用。也可以看成是手性配基、金屬離子和對映異構體(ti) 形成的配合物穩定常數不同而產(chan) 生分離o采用5µm粒徑的C18固定相，阿司帕坦作為(wei) CMPA，與(yu) 硫酸銅絡合，測定高血溶素患者尿中D-和L-2-呱啶酸的濃度。
(2)環糊精添加劑
環糊精在水中有-定的溶解度，用環糊精作為(wei) 手性添加劑，加入流動相中，其分離機理與(yu) 環糊精手性固定相相同,但保留行為(wei) 正好相反。對映異構體(ti) 與(yu) 環糊精形成的包合物穩定性越強，隨流動相出柱越快，保留時間越短。
(3)手性離於(yu) 對添加劑
解離的有機化合物能與(yu) 含互補電荷的試劑相互作用，生成電中性離子對。分離帶電荷的對映異構體(ti) 時，可以在流動相中添加手性的離子對試劑，對映異構體(ti) 和離子對試劑形成電中性的離子對,離子對在固定相和流動相間分配係數不同而得到分離。常用的手性離子對試劑有(+)10-樟腦磺酸、奎寧等。